Уважаемые заказчики! Обратите внимание, что в отделе карантина растений работа с заказчиками по средам не ведется. Это временная мера. Приносим извинения за доставленные неудобства.

Сущность метода ПЦР

ДНК и пробирки.jpgВ ФГБУ «Свердловский референтный центр Россельхознадзора» существует отдел ПЦР-диагностики. Что же такое ПЦР-диагностика? В чём плюсы данного метода работы?

ПЦР – это полимеразная цепная реакция, является экспериментальным методом молекулярной биологии, позволяющим многократно копировать и увеличивать малые концентрации фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в каком-либо биологическом материале (пробе, образце). Причём, будет происходить копирование только тех участков, которые соответствуют заданным условиям, и только в том случае, если этот участок присутствует в исследуемом образце. Полимеразная цепная реакция была изобретена американским биохимиком Кэри Муллисом в 1983 году. Он хотел создать такой метод, который мог бы позволить амплифицировать ДНК, и в ходе проведения ряда исследований ему удалось прийти к нужному результату. Появление такого метода стало целой революцией в молекулярной биологии и медицине. В 1993 году Муллису была присуждена Нобелевская премия за изобретение ПЦР. В наше время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и высокочувствительных методов диагностики различных вирусных и бактериальных заболеваний.

Принцип работы

В любом организме за хранение генетической информации отвечает ДНК – это двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из последовательности четырех нуклеотидов: А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Отсюда и основное правило генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определённом порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе. Каждый организм имеет свою ДНК, и для выявления конкретного вида необходимо иметь лишь её небольшой участок. Некоторые виды хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и её фрагменты можно искать с помощью ПЦР. На обнаружении участков нуклеиновых кислот и строится принцип полимеразной цепной реакции. Для каждого возбудителя существует свой специфический генетический детектор, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания очень большого количества его копий.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в самом простейшем случае требуются следующие компоненты:

- ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;

- два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;

- термостабильная ДНК-полимераза;

- дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);

- ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;

- буферный раствор.

Полимеразная цепная реакция проходит в амплификаторе —приборе, который способен обеспечить периодическое охлаждение и нагревание пробирок с исследуемым материалом, для того чтобы произошла его репликация.

Ход реакции

Обычно выполняется по 35-45 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий. ДНК-матрицу нагревают при температуре 94-96 °C на несколько минут для расхождения цепей ДНК. Такая стадия называется денатурацией – идёт разрушение водородных связей меж двух цепей. Иногда перед первым циклом проводится предварительный прогрев реакционной смеси в течение 3-5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. После расхождения цепей идёт снижение температуры для связи праймеров с матрицей. Такая стадия называется отжигом. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Достоинства метода

Универсальность – одно из самых важных преимуществ метода, ведь с помощью него можно находить различные ДНК и РНК, даже если другие методы не справились с этой задачей. Оборудование для проведения реакции ПЦР, как правило, универсально и не зависит от того, что и где именно мы ищем.

Высокая специфичность – во всех видах материалов, которые отправляются на исследование, определится только их уникальная последовательность нуклеотидов, характерная для конкретных возбудителей. Специфичность ПЦР достигает аж 100%. Более того, в одном и том же виде материала можно искать различные возбудители заболеваний одновременно безо всякого ущерба для качества результатов исследований.

Чувствительность – с помощью высокой чувствительности метода ПЦР можно найти даже один небольшой фрагмент генетического материала искомого материала.

Оперативность – неоспоримое достоинство ПЦР. Постановка реакции занимает несколько часов после выделения ДНК, таким образом, вся диагностика от момента сдачи материала на анализ до получения результата отнимет всего один-два рабочих дня.

Испытательная лаборатория Свердловского референтного центра Россельхознадзора применяет метод ПЦР для выявления ГМО, обнаружения видоспецифичной ДНК КРС/свиньи/курицы/индейки/лошади, а также определения наличия карантинных заболеваний вирусного и бактериального происхождения в растительной продукции.